El iniciar cualquier programa silvícola requiere de genotipos que permitan reflejar los tratamientos silvícolas que en ellos se realizan. La base de ello se logra con un adecuado programa de mejoramiento genético, los cuales promueven la incorporación de los mejores genotipos a la futura masa forestal del país. Esta herramienta, complementaria a los esquemas modernos de establecimiento y silvicultura, permite aumentar la productividad de los bosques naturales y plantaciones a través de incrementos en volumen, mejoramiento de la calidad de la madera y reducción de pérdidas por problemas fitosanitarios y deficiencias de las cualidades fisico-mecánicas de la madera. La biotecnología recientemente ha adquirido un rol central dentro del mejoramiento genético forestal, debido a las reducciones de tiempo que posibilita un mejor y más racional, uso de la variabilidad genética disponible que permite.

Los marcadores moleculares permiten detectar variabilidad genética directamente al nivel del ADN, y alcanzan por lo tanto una resolución superior a otros sistemas como isozimas. La información que ellos generan no se ve afectada por el medio ambiente o la fase de desarrollo de la planta. El marcador más utilizado en especies leñosas hasta el momento es RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA), el cual se basa en un proceso PCR y por lo tanto permiten recoger información genética con mayor velocidad que otras alternativas tecnológicas.

OBJETIVOS

• Desarrollar un protocolo RAPD para Acacio Falso (Robinia pseudoacacia)

• Determinar los patrones de variación molecular en procedencias

de Acacio Falso (Robinia pseudoacacia.)

• Analizar, en términos genéticos, rodales nacionales de Robinia pseudoacacia con aptitud para Areas Productoras de Semillas

La colección de material vegetal se efectuó en distintas formaciones de Robinia pseudoacacia presentes en las regiones VI y VII, estableciéndose 8 procedencias distintas (Cuadro 1). Las semillas fueron germinadas y mantenidas como speedlings en los viveros de INFOR, Concepción. Una vez que las plantas alcanzaron 10 cm. de altura fueron trasladadas al CRI Carillanca (INIA) para su análisis molecular. Se seleccionaron de forma aleatoria 20 individuos distintos entre sí por procedencia, para hacer una muestra poblacional con un total de 160 muestras. El tejido utilizado para extraer ADN fueron hojas nuevas y tiernas, las cuales permiten generar ADN de mejor calidad en especies leñosas como Robinia.

Cuadro 1
Procedencias analizadas

Se utilizó el protocolo básico de Ojeda et al. (1998). Tejidos tiernos foliares son macerados a objeto de romper las membranas celulares, y el macerado fue resuspendido en un buffer de extracción con detergentes, EDTA y antioxidantes, el que permite solubilizar las membranas lipoproteicas y denaturar proteínas y proteger al ADN. La suspensión así formada fue sometida a una extracción orgánica con Cloroformo/alcohol isoamílico. El ADN extraído fue precipitado con alcohol y NaAc 3M y colectado mediante centrifugación. Finalmente, el ADN fue disuelto en buffer Tris-EDTA conteniendo ARNasa para degradar moléculas de ARN.

Para cuantificar y determinar la calidad del ADN extraído se recurrió a lecturas espectrofotométricas a l 260 y l 280 con un espectrofotómetro Perkin Elmer MB2000. La integridad del ADN fue evaluada mediante su inspección visual en geles de agarosa.

Reacciones RAPD

Las condiciones originales de Williams et al. (1990) fueron utilizadas con ADN de Robinia, sin embargo el resultado obtenido no fue satisfactorio, por lo que fue necesario optimizar un protocolo RAPD para Robinia. Se optimizaron las concentraciones de los siguientes componentes: ADN, dNTPs, partidores y Magnesio manteniéndose las concentraciones de Taq ADN polimerasa y buffer PCR.

Separación de productos RAPD

Los productos RAPD fueron separados mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa preparada al 1.2% en buffer TBE 0-5X. La electroforesis se efectuó a 70 Volts durante 3 horas y para visualizar los fragmentos amplificados los geles fueron teñidos con Bromuro de Etidio (0.5 m g/ml.) por espacio de 20 minutos.

Análisis de productos RAPD

La información molecular RAPD fue analizada mediante la cuidadosa inspección visual de los geles por dos personas, codificándose en base binaria. Mediante el software Genepop32 se calcularon frecuencias alélicas y parámetros poblacionales y a través del software NTSYS se efectuó un Análisis de Componente Principal y además se generó un dendograma representativo.

Finalmente, mediante el software AMOVA se descompuso la variabilidad molecular observada en tres estratas distintas: "dentro del rodal"; "entre grupos de rodales" y "dentro de grupos de rodales". La consistencia estadística de la información generada mediante AMOVA se verificó mediante el uso de 1000 permutaciones.

De la información generada mediante el presente estudio es posible concluir lo siguiente:

• Se ha desarrollado un protocolo RAPD para Robinia, el cual puede ser aplicado en múltiples usos posteriores

• Las poblaciones de Robinia pseudoacacia analizadas presentan un adecuado nivel de polimorfismos detectados mediante RAPD

• Las procedencias analizadas conforman un grupo genético mas bien homogéneo, sin embargo la procedencia Santa Adela aparece como genéticamente divergente a las otras procedencias analizadas.

• El análisis AMOVA indica que la principal fuente de diversidad genética en Robinia pseudoacacia se encuentra dentro de las procedencias analizadas, mientras que una proporción mucho menor de la misma se observa entre las procedencias estudiadas. Lo anterior debe considerarse para el futuro establecimiento y posterior desarrollo de Areas Productoras de Semillas a partir de las procedencias incluidas en el presente estudio.